Ancak reform girişimleri ve Yeniçeri Ocağı ile yaşadığı gerilim, onun trajik sonunu hazırladı. 1622 yılında gerçekleşen olaylar, Osmanlı tarihinde ilk kez bir padişahın kendi askerleri tarafından öldürülmesiyle sonuçlandı.

Genç Osman, Hotin Seferi’nin ardından ordudaki disiplinsizliği ve Yeniçeri Ocağı’nın bozulduğunu düşünerek köklü değişiklikler yapmak istedi. Yeniçerilerin gücünü azaltmayı ve daha disiplinli yeni bir askerî yapı kurmayı planladı. Bu düşünceler kısa sürede ocak içinde yayıldı ve büyük tepkiye neden oldu.

1622 yılında başlayan Yeniçeri isyanı kısa sürede büyüdü. İsyancılar saraya yürüdü, Genç Osman’ı tahttan indirerek yerine I. Mustafa’yı yeniden padişah ilan etti. Ardından Genç Osman Yedikule’ye götürüldü ve burada öldürüldü. Bu olay Osmanlı tarihinde devlet otoritesine vurulan en ağır darbelerden biri olarak kabul edildi.

Tarihçiler, Genç Osman’ın ölümünün temel nedeninin Yeniçeri Ocağı’nı reforme etme ve gücünü sınırlandırma girişimi olduğu konusunda görüş birliği içindedir. Onun ölümü, Osmanlı’da askerî ve siyasi dengelerin ne kadar hassas olduğunu gösteren dönüm noktalarından biri olarak değerlendirilmektedir.